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혈소판 풍부 혈장이 탑재된 지혈제

(Hemostatic agent system using PRP)

김민지, 송예진 외, Tissue Eng. Regen. Med. (2024).

본 연구에서는 불가피하게 폐기될 수 밖에 없는, 유통기한이 지난 PRP를 낙엽적층구조를 탑재하여 PRP-FLSS 필름을 제조하였다. 간 출혈 모델을 사용한 동물실험에서 PRP-FLSS가 생체 적합성뿐만 아니라 혈액 응고를 가속화하여 출혈을 매우 효과적으로 방지할 수 있음을 관찰하였고, 이는 LSS 층에 탑재된 활성화된 PRP로부터 다양한 혈액 응고제의 충분한 공급과 LSS 자체의 넓은 표면적의 시너지 효과에 의한 결과라 판단된다. 연구 결과를 바탕으로, PRP-FLSS는 독특한 형태를 가진 다공성 고분자 매트릭스와 버려지는 생체기능 자원의 조합으로, 생체기능 자원의 낭비를 방지하기 위한 업사이클링 플랫폼뿐만 아니라 첨단 지혈제가 될 수 있을 것으로 기대된다.

In this study, a PRP-embedded porous film was prepared, using discarded (expired) PRP and a film with a leaf-stacked structure (FLSS), as a hemostatic agent to induce rapid hemostasis. The film, which contained an LSS on one side (PCL-FLSS), was fabricated by a simple heating-cooling technique using tetraglycol and polycaprolactone (PCL) film. Activated PRP was obtained by the thawing of frozen PRP at the end of its expiration date and embedded in the PCL-FLSS (PRP-FLSS). From in vitro and in vivo experiments using a rat hepatic bleeding model, it was recognized that PRP-FLSS is not only biocompatible but also significantly accelerates blood clotting and thus prevents rapid bleeding, probably due to a synergistic effect of the sufficient supply of various blood coagulants from activated PRP embedded in the LSS layer and the large surface area of the LSS itself. Based on the findings, the study suggests that PRP-FLSS, a combination of a porous polymer matrix with a unique morphology and discarded biofunctional resources, can be an advanced hemostatic agent as well as an upcycling platform to avoid the waste of biofunctional resources.

3D 프린팅 지지체를 활용한 골재생

3D printing bone graft system

김민지 외, Biofabrication, 16, 025014 (2024).

본 연구에서는 PCL으로 만들어진 3D 프린팅 스캐폴드에 낙엽적층구조를 입힌 3D-PLSS를 개발하였으며, 이 스캐폴드에 BMP-2를 탑재하여 골 형성을 촉진하도록 하였다. 스캐폴드를 구성하고 있는 strand의 표면에 낙엽적층구조를 얇은 층으로 도입하고, 단순 흡착을 통해 BMP-2를 도입하여 생리활성인자가 일정 기간 동안 서서히 방출될 수 있도록 설계하였다. 이 스캐폴드가 뼈 재생을 촉진할 수 있음을 세포 배양과 동물 연구을 통해 검증하였다. 이러한 결과를 통해, 생리 활성 분자를

탑재한 3D 프린팅 스캐폴드와 낙엽적층구조의 조합이 향후 임상 및 연구 분야에서 널리 사용될 수 있을 것으로 기대되었다.

Although three-dimensional (3D) printing techniques are used to mimic macro- and micro-structures as well as multi-structural human tissues in tissue engineering, efficient target tissue regeneration requires bioactive 3D printing scaffolds. In this study, we developed a bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)-immobilized polycaprolactone (PCL) 3D printing scaffold with leaf-stacked structure (LSS) (3D-PLSS-BMP) as a bioactive patient-tailored bone graft. The unique LSS was introduced on the strand surface of the scaffold via heating/cooling in tetraglycol without significant deterioration in physical properties. The BMP-2 adsorbed on 3D-PLSS-BMP was continuously released from LSS over a period of 32 d. The LSS can be a microtopographical cue for improved focal cell adhesion, proliferation, and osteogenic differentiation. In vitro cell culture and in vivo animal studies demonstrated the biological (bioactive BMP-2) and physical (microrough

structure) mechanisms of 3D-PLSS-BMP for accelerated bone regeneration. Thus, bioactive molecule-immobilized 3D printing scaffold with LSS represents a promising physically and biologically activated bone graft as well as an advanced tool for widespread application in clinical and research fields.

생체활성형 골이식재

Bioactive bone graft system

김민지 외, ACS Biomater. Sci. Eng., 8, 5233-5244 (2022).

손상된 뼈조직은 원래 상태로 회복될 수 있지만, 임상에서 임계 크기의 뼈 손상은 손상 부위의 스캐폴딩 매트릭스와 성장 인자의 결핍으로 인해 여전히 난제로 남아 있다. LSS입자에 BMP-2를 탑재하고 지속적으로 방출할 수 있도록 설계하여서

세포실험 및 동물실험에서 골 형성 분화 및 뼈 재생에 유리한 환경을 제공함을 확인하였다. 이러한 결과는 LSS 입자가 뼈 미네랄과 비슷한 구조를 가져 골재생 촉진을 위한 하나의 물리적 자극제로 작용하고, 지속적으로 공급되는 BMP-2는 생물학적인 자극으로 작용했기 때문이라 판단된다. 이러한 결과를 토대로, BMP-2를 함유한 LSS 입자는 효과적인 뼈 형성을 위한 유망한 생체활성형 골 이식재로 활용될 수 있을 것이다.

Even though bony defects can be recovered to their original condition with full functionality, critical-sized bone injuries continue to be a challenge in clinical fields due to deficiencies in the scaffolding matrix and growth factors at the injury region. In this study, we prepared bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)- loaded porous particles as a bioactive bone graft for accelerated bone regeneration. The porous particles with unique leaf-stacked morphology (LSS particles) were fabricated by a simple cooling procedure of hot polycaprolactone (PCL) solution. The unique leaf-stacked structure in the LSS particles provided a large surface area and complex release path for the sufficient immobilization of BMP-2 and sustained release of BMP-2 for 26 days. The LSS was also recognized as a topographical cue for cell adhesion and differentiation. In in vitro cell culture and in vivo animal study using a canine mandible defect model, BMP-2-immobilized LSS particles provided a favorable environment for osteogenic differentiation of stem cells and bone regeneration. In vitro study suggests a dual stimulus of bone mineral-like (leaf-stacked) structure (a physical cue) and continuously supplied BMP-2 (a biological cue) to be the cause of this improved healing outcome. Thus, LSS particles containing BMP-2 can be a promising bioactive grafting material for effective new bone formation.

세포 스페로이드

Cell spheroid

김민지, 정영조 외, Chem. Eng. J., 429, 132590 (2022).

세포 스페로이드는 조직 공학에서 널리 사용되고 있지만, 세포 이질성, 낮은 구조적 안정성, 제어되지 않는 세포 분화 등의 임상적 한계를 가지고 있다. 이 연구에서는 기존 세포 스페로이드의 한계를 극복하기 위해 생리활성인자를 탑재한 LSS 입자를 사용하여 새로운 세포 스페로이드를 개발하였다.

다공성 LSS 입자는 산소와 영양분의 확산을 통해 세포 이질화를 방지하고, LSS 입자의 세포 접착 표면은 구조적인 안정성을 향상시킴을 확인할 수 있었다. 또한, LSS 입자에서 방출된 생리활성인자는 줄기세포의 골 형성 분화를 유도하고, 새로운 뼈 형성을 촉진시킴을 확인하였다. 이러한 결과는 본 연구팀이 개발한 세포 스페로이드가 기존의 세포 스페로이드의 한계를 극복할 수 있는 잠재적인 전략이 될 수 있음을 시사한다. 이에 따라 LSS 입자에 생리활성인자를 탑재한 세포 스페로이드는 다양한 조직과 장기의 재생을 위한 효과적인 플랫폼으로 활용될 수 있으리라 판단된다.

Despite the widespread use of cell spheroids in tissue engineering for the regeneration of large tissues and organs and for high-throughput screening in pharmacology and toxicology, the clinical challenges include cellular heterogeneity, low structural stability, and uncontrolled cell differentiation. Using human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMSCs), we developed cell spheroids containing bioactive molecule (bone morphogenetic protein-2, BMP-2)-immobilized polycaprolactone (PCL) particles with a leaf-stacked structure (LSS). The LSS particles were fabricated via simple heating–cooling method, and the BMP-2 was continuously released from LSS particles for 19 days. Based on in vitro and in vivo observations of the cell spheroids, we found that (i) the porous LSS particles prevent cellular heterogeneity via sufficient diffusion of oxygen/nutrients, (ii) the cell adhesive surface on LSS particles improved the structural stability, (iii) the BMP-2 released from LSS particles induced effective osteogenic differentiation of stem cells, and (iv) the BMP-2-immobilized LSS particles induced new bone formation. Therefore, the cell spheroid containing bioactive molecule-immobilized LSS particles represent a potential strategy to overcome the inherent limitations of conventional cell spheroids. We further suggest that the cell spheroid containing bioactive molecule-immobilized LSS particles is an elegant platform for the regeneration of various tissues and organs as well as high-throughput screening in pharmacology and toxicology studies.

척추 디스크 재생

Intervertebral disc regeneration

김민지 외, Biomacromolecules, 21, 4795-4805 (2020).

척추 디스크 재생에 성장인자와 세포이식을 기반으로 생물학적 치료법이 연구되었으나, 성장인자의 반복적인 주입과 주사부위에서 세포 누출이 되는 한계가 있다. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위하여 인체 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBMSC)와 형질전환 성장인자(TGF-β3)를 탑재한 다공성 입자(LSS)를 개발하였다. hBMSC/TGF-β3가 탑재된 LSS 입자가 hBMSC의 연골 분화를 촉진하고 동물모델에서 추간판 재생을 효과적으로 유도할 수 있음을 관찰하였다. 이는 주입된 LSS 입자가 다양한 조직의 재생을 위한 효과적인 생리 활성 전달 시스템으로의 활용 가능성을 보여주는 결과라 판단된다.

Although biological therapies based on growth factors and transplanted cells have demonstrated some positive outcomes for intervertebral disc (IVD) regeneration, repeated injection of growth factors and cell leakage from the injection site remain considerable challenges for human therapeutic use. Herein, we prepare human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMSCs) and transforming growth factor-β3 (TGF-β3)-loaded porous particles with a unique leaf-stack structural morphology (LSS particles) as a combination bioactive delivery matrix for degenerated IVD. The LSS particles are fabricated with clinically acceptable biomaterials (polycaprolactone and tetraglycol) and procedures (simple heating and cooling). The LSS particles allow sustained release of TGF-β3 for 18 days and stable cell adhesiveness without additional modifications of the particles. On the basis of in vitro and in vivo studies, it was observed that the hBMSCs/TGF-β3-loaded LSS particles can provide a suitable milieu for chondrogenic differentiation of hBMSCs and effectively induce IVD regeneration in a beagle dog model. Thus, therapeutically loaded LSS particles offer the promise of an effective bioactive delivery system for regeneration of various tissues including IVD.

생체활성형 성형 필러

Bioactive cosmetic filler system

김민지, 안보슬 외, ACS Biomater. Sci. Eng., 6, 2231-2239 (2020).

본 연구의 궁극적인 목적은 주름 부위의 볼륨을 복원하고(수동적 특성), 신호 분자를 지속적으로 방출하여 연조직을 모집함으로써(생체 활성 특성) 얼굴 노화를 효과적으로 교정할 수 있는 생체 활성 필러 시스템을 개발하는 것이다. 이를 위해, 간단한 가열-냉각 기술을 사용하여 입자 전체에 걸쳐 잎이 쌓인 구조의 다공성 입자(LSS 입자)를 제조하였다. LSS 입자는 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1)과 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 용액에 간단한 침지를 통해 제조하였다 (IGF-1는 지방조직 유도, VEGF는 혈관조직 유도). 입자의 고유한 형태 덕분에 추가적인 화학적/물리적 변형 없이도 시험관 내에서 각각 28일과 21일 동안 LSS 입자에서 IGF-1과 VEGF가 지속적으로 방출됨을 관찰하였다. 신호 분자는 in vitro 내(지방 생성 및 혈관 신생 분화 유도)와 in vivo (지방 및 혈관 모집)에서 충분한 기간 동안 생체 활성을 유지함도 관찰되었다. 또한 LSS 입자 자체는 체내에서 안정적인 부피 유지 특성을 갖는 것으로 관찰되었다. 따라서 신호 분자가 탑재된 LSS 입자가 부피 유지 및 표적 조직 재생을 위한 생체 활성 필러 시스템으로 기능할 수 있음을 확인할 수 있었다.

The ultimate purpose of this study was to develop a bioactive filler system that would allow volume restoration (passive property) and continuous release of signaling molecules to recruit soft tissues (bioactive property) and thus effectively correct facial aging. To achieve this, we prepared porous particles with a leaf-stacked structure throughout the entire particle volume (LSS particles) using a simple heating−cooling technique. LSS particles were loaded with insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) separately, by immersing the particles in signaling molecule-containing solutions for target tissue recruitment (adipose by IGF-1 and blood vessels by VEGF). IGF-1 and VEGF were continuously released from LSS particles for 28 and 21 days in vitro, respectively, even without additional chemical/physical modifications, because of the unique morphology of the particles. Signaling molecules preserved their bioactivity in vitro (induction of adipogenic and angiogenic differentiation) and in vivo (recruitment of fat and blood vessels) for a sufficient period. Moreover, it was observed that the LSS particles themselves have stable volume retention characteristics in the body. Thus, we suggest that the signaling molecule-loaded LSS particles can function as a bioactive filler system for volume retention and target tissue regeneration.

산소공급이 가능한 조직공학용 시스템

Oxygen-releasing system

이혜영, 김호용, 김소영 외, Biomaterials, 53, 583-591 (2015) & Biomacromolecules, 20(2), 1087-1097 (2019).

임상 적용 가능한 3차원 스캐폴드에서 타겟조직으로 충분한 산소를 전달하는 것은 여전히 어려운 과제다. 이러한 한계를 극복하기 위해 본 연구에서는 산소 운반체인 PFO-HP 에멀젼을 탑재한 hollow microparticles (HP)를 제조하였다. 이러한 PFO-HP는 저산소 상태에서 인간 골막 유래 세포(hPDC)의 생존을 연장하고, 골 형성 분화를 촉진시켰다. PFO-HP에 배양된 hPDC는 인산염 완충 식염수를 탑재한 대조군 HP에 배양된 hPDC보다 더 빠른 속도와 더 높은 골밀도로 새로운 뼈를 형성했다. 이러한 결과는 PFO-HP가 혈관 내 새로운 혈관 성장이 일어날 때까지 혈관 네트워크가 없는 골 결손부에서 hPDC의 분화 능력의 생존 및 유지에 적합한 환경을 제공하여 골 재생을 향상시킨다는 것을 시사한다. PFO-HP는 손상된 조직/장기를 재생하기 위해 줄기 세포 및 전구 세포를 포함한 다양한 기능 세포의 효과적인 전달을 위한 유망한 시스템이 될수 있다고 판단된다.

Sufficient oxygen delivery into tissue-engineered three-dimensional (3D) scaffolds to produce clinically applicable tissues/organs remains a challenge for researchers and clinicians. One potential strategy to overcome this limitation is the use of an oxygen releasing scaffold. In the present study, we prepared hollow microparticles (HPs) loaded with an emulsion of the oxygen carrier perfluorooctane (PFO; PFO-HPs) for the timely supply of oxygen to surrounding cells. These PFO-HPs prolonged the survival and preserved the osteogenic differentiation potency of human periosteal-derived cells (hPDCs) under hypoxia. hPDCs seeded onto PFO-HPs formed new bone at a faster rate and with a higher bone density than hPDCs seeded onto phosphate buffered saline-loaded control HPs. These findings suggest that PFO-HPs provide a suitable environment for the survival and maintenance of differentiation ability of hPDCs at bony defects without vascular networks until new blood vessel ingrowth occurs, thus enhancing bone regeneration. PFO-HPs are a promising system for effective delivery of various functional cells, including stem cells and progenitor cells, to regenerate damaged tissues/organs.

생체활성형 골유도 재생막

Bioactive GBR membrane

김호용, 박진현 외, ACS Appl. Mater. Interfaces, 10, 30115-30124 (2018).

본 연구에서는 PCL/F127 혼합 용액을 활용하여 비대칭 다공성 막(LSS 막)을 제조하였다. 이 막에 BMP-2를 탑재하였고, 탑재된 BMP-2는 38일 동안 지속적으로 방출되어 골 형성 분화 및 뼈 재생을 촉진하였다. 또한, 낙엽적층구조는 뼈 재생을 위한 물리적 자극으로 작용하며, 지속적으로 방출되는 BMP-2와 유사한 수준을 보임도 관찰하였다. 따라서, 본 연구팀은 BMP-2 탑재 LSS 멤브레인이 효과적인 골형성 분화 및 뼈 재생으로 인해 임상 적용을 위한 생체활성형 골유도재생막(GBR)이 될 수 있으리라 판단하였다.

We developed an asymmetrically porous membrane with a leaf-stacked structure (LSS membrane; top with nanosized pores and bulk/bottom with leaf-stacked structure) via immersion−precipitation using polycarprolactone (PCL)/Pluronic F127 mixture solution (in tetraglycol). The bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) is immobilized on the pore surfaces of the LSS membrane by immersing the membrane in the BMP-2 solution. The BMP-2 loaded in the LSS membrane is continuously released for 38 days (without additional modifications of the matrix) to improve osteogenic differentiation of cells and new bone formation (carvarial defect rat model). The leaf-stacked structure is recognized to be a physical stimulus for bone regeneration, and the stimulation effect is comparable to that of continuously released BMP-2. Moreover, we observe the combined effect of BMP-2 and the leaf-stacked structure for bone healing. Thus, we suggest that the BMP-2-immobilized LSS membrane may be a candidate as a bioactive guided bone regeneration (GBR) membrane for clinical applications, due to the use of clinically acceptable biomaterials and fabrication procedures as well as effective osteogenic differentiation and bone regeneration.

생리활성인자 전달시스템

Drug delivery system

김호용, 이한아름 외, ACS Appl. Mater. Interfaces, 10, 21091-21102 (2018).

약물전달시스템에서 생체 활성 분자를 지속적으로 방출하는 것은 중요하지만, 기존 전달 시스템의 잔류 독성 시약, 독한 유기 용매의 사용, 복잡한 제조과정은 임상 사용에 큰 장애물이 되어왔다. 본 연구에서는 임상적으로 사용 가능한 재료와 제조과정을 활용하여 제조된 LSS 입자에 BMP-2를 탑재하였다. BMP-2는 최대 36일까지 지속적으로 방출되어 인간 골막 유래 세포의 골 형성 분화 및 새로운 뼈 형성에 적합한 환경을 제공함을 관찰하였다. 따라서 낙엽적층구조는 성장인자, 호르몬, 사이토카인, 펩타이드 등과 같은 다양한 생리활성인자를 효과적으로 전달할 수 있는 간단하지만 임상적으로 적용할 수 있는 플랫폼이 되리라 판단된다.

Sustained release of bioactive molecules from delivery systems is a common strategy for ensuring their prolonged bioactivity and for minimizing safety issues. However, residual toxic reagents, the use of harsh organic solvents, and complex fabrication procedures in conventional delivery systems are considered enormous impediments toward clinical use. Herein, we describe bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)- immobilized porous polycaprolactone particles with unique leaf-stacked structures (LSS particles) prepared using clinically feasible materials and procedures. The BMP-2 immobilized in these LSS particles is continuously released up to 36 days to provide an appropriate environment for osteogenic differentiation of human periosteum-derived cells and new bone formation. Thus, the leaf-stacked structures of these LSS particles provide a simple but clinically applicable platform for effectively delivering a variety of bioactive molecules, such as growth factors, hormones, cytokines, peptides, etc.